微生物来源药物制备工艺研究中质量控制要素讨论(三)--提取工艺的过程

审评三部张哲峰

发酵结束后的发酵液组成情况非常复杂，处理措施与化学合成法明显不同。通常情况下，发酵液中目标物浓度很低，而杂质含量却很高，成份远较化学反应母液情况复杂，大量菌体细胞、培养基、各种蛋白质胶状物、色素、金属离子和其它代谢物等混杂其中，使得发酵液的预处理对于目标物的最终获取非常必要。
1、发酵液预处理的目的是使发酵液中的蛋白质和某些杂质沉淀，以增加滤速，过滤的目的是使菌丝体与发酵液分离，以便从发酵液或菌丝体中提取目标物。预处理阶段主要去除两大类杂质：可溶性黏胶状物质(核酸、杂蛋白、不溶性多糖等)和无机盐（不仅影响成品炽灼残渣，还会影响离子交换法提取目标物的收率）。
确定预处理方法前，首先要明确目标物存在于胞内（菌体）还是胞外（发酵液），以确定弃去和收集的对象；还要结合目标物的稳定性等特点，选择预处理的pH、温度和化学试剂等。对于菌丝体及杂蛋白的处理一般可采用等电点沉淀、变性沉淀、沉淀剂沉淀、加入絮凝剂、加入凝聚剂、吸附以及酶解法去除不溶性多糖等措施，对提取效果和成品质量影响较大的无机杂质主要是Ca2+、Mg2+、Fe3＋等高价金属离子，可采用离子交换法、沉淀法等措施去除。加入的预处理试剂除要考虑到处理效果外，还要考虑低毒性、利于环保以及易于从终产品中除去等因素，申报时应说明所采取的措施及加入的试剂，必要时在成品质量研究中检测其残留量。
液－固分离是发酵液预处理的重要步骤，通常采用板框压滤、真空过滤以及离心分离等措施，过滤是各种措施中普遍存在的一个环节，为提高过滤效果、提高滤液质量，通常加入助滤剂，选择助滤剂时除考虑其效果和成本外，无毒，惰性，不与滤液和目标物产生化学反应对于终产品的质量和安全性尤为重要。
预处理后的滤液是生产过程中重要的中间产物，类似于化学反应中的中间体，有必要制订其质量控制标准，比如，一般情况下要澄清、有一定浓度、pH适中，需要说明的是，后续的提取工艺不同，对滤液的质量要求不同，如离子交换法提取目标物时对无机离子、澄清度等方面要求较严格，溶媒法提取时要求滤液蛋白含量较低。总之，经预处理后的滤液控制标准应根据其后的提取工艺综合确定。
2、目标物的提取是采用物理或化学手段从发酵液或菌丝体中得到目标物的浓缩液或粗制品。常用的提取方法有溶媒萃取法、离子交换法、吸附法以及沉淀法。具体采用何种提取方法需结合目标物化学结构特征、产品组份情况、拟采用的终产品精制工艺、终产品质量要求以及对终产品安全性的影响等因素综合考虑。
●溶媒萃取法在目前的微生物药物尤其抗生素生产中的应用较为普遍，特点是产品纯度、颜色等质量特征较好，尽管离子交换技术已比较发达，但还不能完全替代溶媒萃取法。需要注意的是一定要关注溶剂的安全性，选用毒性低的溶剂如常用乙酸乙酯、乙酸丁酯和丁醇等，用到的溶剂要在质量标准中进行残留量的严格控制，一般不选用1类和2类溶剂；另外，所用溶剂对目标物应具有较好的溶解性和选择性，少量即可提取完全，并使目标物和杂质良好分离。乳化现象是溶媒萃取法中需要克服障碍，如使用去乳化剂，应考虑其安全性以及从终产品中的残留情况，必要时检测其残留量。
●离子交换法因成本低、设备简单、不用或少用有机溶剂等优点，已成为提取抗生素的重要方法之一，如许多氨基糖苷类抗生素和多粘菌素等多用此法提取。但有时产品质量特征稍不如意，另外，此种提取过程中pH变化较大，不适于稳定性较差目标物如青霉素等的提取。解吸附时常用水、稀酸、盐或其他络合剂等，一般说来，酸性吸附碱性洗脱，碱性吸附酸性洗脱，为防止洗脱过程pH变化过大，避免影响目标物稳定性，可选用缓冲液洗脱剂，有时还会用到含有机溶剂的洗脱剂以提高洗脱效果，需要考虑的是洗脱剂对目标物的影响、洗脱剂的安全性及其在终产品中的残留情况，如NH4+和链霉素反应会生成毒性很大的二链霉胺，故吸附链霉素后的饱和树脂不可使用氨水洗脱。
●吸附法在早期的微生物药物如青霉素、林可霉素以及维生素B12等的提取中应用较多,吸附剂为活性炭、酸性白土以及弱酸性离子交换树脂等，按原理可分为物理吸附、化学吸附和交换吸附等类型。因选择性差、收率不高等缺点，在后来的生产中渐被其它方法取代，但近期随着大孔网状聚合物吸附剂的合成和发展，重又得到重视和应用。使用时需要关注溶液pH对目标物稳定性的影响以及解吸附剂的安全性及其在终产品中的残留情况。
●沉淀法提取目标物在国内应用较为广泛，尤其在四环类抗生素的生产中应用较多，一般可分为间接沉淀和直接沉淀两种类型。如用到沉淀剂，需要考虑其安全性、对目标物稳定性的影响以及在终产品中的残留情况。另外，沉淀法得到的产品一般颗粒粗大，必要时要经过粉碎、重新溶解结晶等措施，控制产品一定的粒度，保证临床有效性。
3、目标物的精制是指将提取得到的目标物浓缩液或粗制品进一步纯化为终产品，所采用的方法与化学合成产物的精制方法大体相同，如浓缩干燥法、结晶与重结晶法、盐析法和晶体洗涤法，鉴于微生物药物多具有化学结构不稳定以及粗品中含有残存蛋白、同系物、异构体、色素等杂质的特点，色谱纯化、分子筛纯化等方法对于保证终产品纯度等质量特征以及降低临床应用中的致敏性等具有重要意义，是比较理想的精制方法。目标物的精制是制备工艺的终端步骤，对精制效果、产品质量特征乃至临床安全性的关系更为直接，采取的措施以及使用的试剂需要引起密切关注。
由于制备工艺的特殊性，对于微生物药物来讲，脱色、去热原是精制其注射用原料药过程中不可或缺的一个单元操作，对终产品的质量特征及临床安全性至关重要。色素是本身带有颜色并能使其它物质着色的高分子有机物质，一般来说，是发酵过程中产生的代谢产物，与菌种和发酵条件有关。虽然在发酵液预处理和目标物提取时会除去大部分色素和杂质，但仍会有少量残存物随目标物一起转移到粗制品或浓缩液中，精制时尤需关注。热原也是发酵过程中产生的代谢产物，多是多糖的磷类脂质和蛋白质等物质的结合体，是一种不挥发的大分子有机物，能够通过一般过滤器进入滤液，但可被活性炭等吸附，200℃加热2h或250℃加热30min方可彻底破坏，其它方法如强酸、强碱以及强氧化等也可破坏热原，但鉴于微生物药物的稳定性特点，多数采用活性炭或二乙胺基乙基葡聚糖凝胶吸附的方法去除热原，但活性炭应事先用酸及无盐水等适当处理，以除去炭表面的杂质，以防止新杂质的引入。

注射用无菌原料药的质量要求除应具备一般原料药的质量特征外，还要具备可靠的无菌保证水平、无热原（细菌内毒素）、可见异物和溶液颜色不能超过相关规定。由于这类药物稳定性的限制，往往不能采用高温、高压的灭菌方式，在精制过程中通常采用过滤除菌、无菌操作等措施保证产品质量，需要根据目标物的具体特点，采用合适的精制工艺，进行灭菌工艺的研究和验证，并严格执行GMP要求和根据相应研究制订的SOP。
小结
微生物药物的制备工艺具有明显不同于化学合成药的特点，生物合成过程的复杂性，决定了以过程控制的手段把握产品质量的重要性，本文从菌种的源头控制、发酵工艺的过程控制以及提取工艺的过程控制三个方面探讨了掌控药品质量的要素，旨在为同类药品的研发和技术审评提供一定参考，其中有些观点仅为个人看法，定有不妥之处，欢迎业界同仁讨论交流。

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