化学药物人体生物等效性试验中分析方法的确证

审评三部六室赵亚男赵明

国家食品药品监督管理局审评中心于2005年发布了《化学药物临床药代动力学研究指导原则（[H]GCL1-1）》，以及《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则（[H]GCL2-1）》。因为指导原则是指导性文件，不是操作手册，不可能事无巨细详尽方法学所有的细节问题。由于我国临床研究水平参差不齐，对临床试验的技术性问题认识和掌握程度不同，相同的试验不同的试验单位在试验过程中对指导原则理解和掌握会出现很大的差异，因此有必要对指导原则的要求作具体的补充说明。本文仅对分析方法的确证进行阐明，希望能对企业和试验单位有一定的帮助，个人观点，仅供参考。
一、分析方法确证的重要性
要得到可靠的试验结果，有必要充分论证分析方法的可靠性。有时尽管采用了文献的方法，但因仪器、试剂及操作人员不同，也应进行分析方法的确证，应有必备的分析方法质量控制标准，由于定量分析结果将直接影响有关参数的准确、可靠，这不仅关系到药物的开发，最终也影响到药物临床应用的安全性和有效性。所以分析方法的考证应当予以充分的重视，其考核过程称为确证或认证。
二、生物样品的特点
与常规的药物分析样本不同，生物样本具有以下特点：
1．样品量少、浓度低：ug、ng、pg、fg、每次取血量又有限，因此常规的化学分析法不适合用作生物样品的分析。
2．干扰因素多：如无机盐、蛋白质、内源性物质、代谢产物及可能存在的其他物质或药物的干扰，而常规药物分析样本中不含这些物质。
3．药物浓度随取样时间而变化：从取样开始到最后，药物浓度相差10-100倍以上，因此空白误差对试验后期的测定结果影响很大。
4．个体差异大：不同受试者，甚至同一受试者在不同时间取样，药物浓度及干扰物质可能有较大的变化。
5．样本量大。
由于生物样品的特殊性和复杂性，分析方法的确证是从各个方面保证方法的正确性，保证试验结果的可信性。
三．分析方法的确证
从目前情况看，色谱法应用最广，大约90%以上的体内药物浓度测定都可以用色谱法来完成。
新药申报资料涉及到的人体生物等效性试验的药物分析方法，无论是新建立的，或移植文献方法的修改，都应对以下项目进行确证。
1．灵敏度LLOQ：定量下限是标准曲线上的最低浓度点。至少应满足测定3～5个半衰期的药物浓度，或Cmax的1/10～1/20时的药物浓度。其准确度应在真实浓度的80～120%范围内，RSD应小于20%。其响应应为空白生物基质干扰物响应的5倍。至少应由5个标准样品测试结果证明。
2．特异性：必须证明所测得物质为目标物质，内源性物质和相应的代谢物应不得干扰样品的测定。多组分定量分析时应对每一待测物进行考察，以保证它们互相之间不产生干扰。提供空白样本图和用药后的样本图。考察不同来源（n 6）空白生物样品色谱图，标准生物样品色谱图（注明浓度），实际生物样品色谱图。空白生物样品中干扰物质的响应不超过待测物定量下限时响应的20%
3．精密度：反应方法的精密度用批内、批间相对标准差（以RSD表示，也称变异系数，用CV表示）RSD=（S/X）X100%。RSD 15%，低浓度RSD 20%。选择3个浓度的质控样品考察方法的精密度和准确度，低浓度选择在定量下限附近，< 3 LLOQ，高浓度接近于标准曲线上限浓度，75～90%。测定3个分析批，每批每一浓度至少5个样品。
4．准确度：质控样品的相对偏差，允许范围85～115%，低浓度80～120%。
5．提取回收率：样品提取过程前、后，分析物含量百分比。应考察低、中、高3个浓度的提取回收率。其结果应当基本一致、精密和可重现。
6．标准曲线：相关系数要求：色谱法大于0.99、生物法大于0.98，关于回归方程y=a+bx中的截距a，由于存在偶然误差，故零截距很难达到，但其值应很小。截距反应空白样品响应值，故有人建议将其折算成浓度后应低于LLOQ的20%。配制标准曲线时所用生物基质必须与实际研究样品生物基质相同。必须用至少6个非零浓度样品建立标准曲线；根据待测物浓度与响应的相关性，用回归分析法获得标准曲线；计算标准曲线时不包括空白点；标准曲线高、低浓度范围为定量范围；定量范围要能覆盖全部待测浓度，不允许外推。在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。每条标准曲线至少3/4的浓度点测定值不能超出真实值的15% （LLOQ浓度点不超出真实值的20%）。实际分析中可以用双样本分析，保证每个浓度点至少有一个测定值在误差范围内。
7．稳定性：选择大、中、小三种浓度，应考察的药物标准溶液的稳定性，含药生物样品冷冻储存条件下的稳定性；含药生物样品在室温、冻融条件下的稳定性；样品处理过程中的稳定性；样品处理后在溶液中的稳定性；储备液的稳定性。总之有充分的证据证明试验的全过程中所有的试验条件下样品的测定均是稳定的。这是体内药物浓度测定结果真实、可信的基础。
8．随行标准曲线和质控样本：在生物介质中加入已知量分析物配制的样品用于监测分析方法的重现性、评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。为了减少误差，用双样本分析，分别放在每批试验的开始和结束位置较好。质控样品分布在批样品之间，最好在不同的受试者样品之间放置，根据每位受试者测定样品的数量不同调整质控数量，但要保证每批质控样本不得少于5%。其他的具体内容在指导原则中有详细的要求，这不再赘述。
一般来说，方法经确证各项指标达到QC要求后，则生物样品的分析用单份样本即可。不必进行双样本或多样本测定。
以上内容在指导原则中都有要求，但有些内容需要强调。在实际工作中很多单位忽视稳定性试验和随行标准曲线和质控，而这两部分内容恰恰是受试者血药浓度测试数据真实、可靠的保证。
由于生物样品的特殊性和复杂性，分析方法的确证就显得格外重要，只有一个正确、稳定、精密、准确的方法和质量控制才能保证药代动力学参数真实反映药物在体内的特征，我们的药物评价才有意义。

化学药物人体生物等效性试验中分析方法的确证

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