重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价一般原则

一、前言
    对于结构复杂、带有糖基化修饰基团的抗体、凝血因子、酶、激素等生物大分子，通常需要借助哺乳动物细胞才能正确表达和修饰成与预期生物活性相同的重组制品。随着生物工程技术的进步和发展，目前这些细胞应用不断增多。
    在宿主细胞选择、重组工程细胞构建以及生产细胞的培养扩增和监控过程中，不仅要关注细胞的适用性、目的产物表达生产能力，同时还应当重视伴随细胞培养产生的内源性病毒、宿主细胞残余蛋白和DNA、致肿瘤成分等潜在的风险性因素对重组产品带来的安全性影响，在早期研究阶段，同步开展库细胞、生产培养过程细胞、生产终末细胞的全面检定和控制以及病毒和/或致瘤性成分的去除/灭活工艺的验证。
（一）目的和意义
    经过全面检测的种子细胞是实现重组基因工程产品生产的前提和基础，使生产用种子细胞具有共同的始祖细胞，保持相同的遗传和生物学特征，在特定的培养环境和条件下持续稳定表达携带的外源目的基因；经过研究确定细胞在扩增培养和生产过程中的变化，才能够有效控制风险性因素，满足生产的持续需求，使产品质量保持一致。
    本技术评价一般原则重在阐述重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制的基本内容和相关要求，以期引导开展全面完整的细胞质量试验研究、生产细胞培养工艺验证，建立系统规范的重组工程细胞库及实现生产过程细胞质量的有效监控。
（二）适用范围
    本技术评价一般原则适用于生产治疗用重组制品的哺乳动物细胞，不包括细菌、酵母等重组工程菌，也不包括治疗用体细胞、疫苗生产用细胞基质、杂交瘤细胞等。相关内容可参见国家局已颁布的指导原则和药品审评中心公布的药品技术评价一般原则，重组制品生产用哺乳动物细胞亦须符合这些已有文件的相关要求。
（三）局限性
    本技术评价一般原则主要结合目前对于重组工程细胞结构、功能，细胞致瘤性和内源性病毒对重组产品带来的风险及微生物污染因子的危害性共识，提出技术审评关注的重点问题和基本原则，需要结合具体细胞和实际培养控制条件考虑和选择。
二、宿主细胞的选择
    应选择来源、背景十分清楚的适宜宿主细胞，明确存在的内源性病毒和/或致瘤性等影响制品安全性的因素，并结合制品纯化的程度、细胞培养和生产过程中风险性成分的去除/灭活能力及残留量控制水平，以及临床应用适应症和用法用量等特点综合分析，经利弊权衡后确定与特定制品相适应的宿主细胞。应首先选择致瘤性试验阴性和低增殖代次水平的宿主细胞。
    对于全新构建的转化细胞、从未使用过的改良传代细胞，甚至肿瘤细胞等，由于前期研究、背景资料和致瘤性风险等积累的认识十分有限，其开发应用将引入新的安全性隐患，需要慎重权衡利弊，在开展充分研究的基础上严格控制潜在的风险性。
（一）宿主细胞来源、传代保存经过和一般特性
    用于构建重组工程细胞的宿主细胞其来源和传代保存过程应清楚，可溯源有关背景资料，例如最初分离建立株/系的机构，在不同机构内引进和传代经过，既往进行过的检测分析项目和确证研究结果，细胞保存状态，经体外传代培养已达到的增殖代次/水平及传代过程中所用过的人源或动物源性材料等。传代保存过程中细胞应保持原有特征，没有发生变异和污染。优先选用最初建立的细胞系或由其传代保存的低代次细胞。
1、宿主细胞来源和传代保存经过
   应提供宿主细胞来源的相关资料和证明性文件，说明是否曾进行过遗传操作引入了外源基因序列，描述已进行过的研究检定项目例如细胞鉴定、内源和外源性因子检测等的结果及引进时进行的复核检定结果。
2、宿主细胞一般特性
    需阐述宿主细胞的基本特征，如形态、培养和生长一般特征、培养条件和培养液要求。新构建的细胞系应检测致瘤性特征。
三、重组工程细胞克隆构建过程、筛选及鉴定
    目前可采用多种表达载体、宿主细胞、基因导入方法和筛选标记等进行工程细胞的构建和筛选，构建成功的标志是工程细胞能够稳定、高效地表达结构正确且具有生物活性的目的产物。应尽可能提供关于重组工程细胞构建和鉴定的详细资料并重点描述：
（一）目的基因来源
    应包括最初获得目的基因序列的来源和背景方面的资料，用于制备目的基因cDNA的方法，以及必要的初步序列分析。
（二）表达载体的具体构建步骤
    需说明表达载体组成成分以及主要元件的来源和功能，包括插入基因和侧翼区序列、复制子、启动子、增强子、抗性标记以及主要的酶切位点等。应详述表达载体构建或改建的过程。对构建成功的表达载体应进行必要的鉴定，并提供相关试验资料如构建中所用位点的酶切图谱等。
（三）载体引入宿主细胞的方法及重组工程细胞的筛选
    应详细说明载体引入宿主细胞的方法和操作过程，重组工程细胞的筛选原理、条件和标准，以及采用何种方法增加基因拷贝数等。阐述外源基因引入宿主细胞后产生的变化，符合筛选标准的候选细胞可能为多个细胞株，但拟用于建库的细胞株应为经研究比较后确定的单一细胞克隆。
（四）重组工程细胞的初步鉴定
    应检测重组后细胞基本性状的改变，比较研究插入外源基因后细胞致瘤性特征的改变。应说明表达载体在宿主细胞内的状态（是否整合到染色体）并采用适宜的方法测定其拷贝数。说明启动和控制目的基因在宿主细胞中表达所采用的方法，并进行初步的表达产物鉴别和表达水平检测。
    对于选定的工程细胞株应进行充分的目的基因全序列确认，以保证用于编码和表达目的产物的基因在初始核酸序列上的正确性。
四、重组工程细胞库的建立
    连续传代细胞生产重组制品的最大优点是使每批产品都有一个经过检定的共同起源细胞，因此建立细胞库的目的就是为了保证生产的可持续性和产品质量的稳定。重组制品的生产必须建立在良好的细胞库管理基础上。
（一）细胞库建立
    细胞库可为三级即原始细胞库、主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）；也可采用主细胞库和工作细胞库组成的两级细胞库；在某些特殊情况下，也可使用主细胞库一级库。用于建库的初始工程细胞株应为经过克隆选择而形成的均一细胞群体，必要时须经与实际生产过程采用的无血清培养基和培养条件相一致的适应性培养。
（二）建库细胞的管理
    在制备WCB过程中不得进行单克隆筛选，以避免由于个别基因突变引起WCB中细胞群体性的遗传特性改变；为了保证细胞库中每个容器中的内容物完全一致，如培养细胞采用几个器皿的，应将所有培养皿中的细胞混合成单批后再分装。
    在细胞库的建库期间应采取适宜的预防措施，以确保细胞不被污染（包括微生物污染和实验室中其他类型细胞的交叉污染等）。
    上述各级种子库的细胞应按照特定的要求经过全面检定合格后方可使用（具体要求参见本文细胞库检定）。
    对于细胞库建库的具体过程、方法和管理的要求，参见参考文献[1]。
五、细胞库检定
    正确的起始细胞是实现良好生产的前提和基础。检定的目的是为了确认经过初步筛选建库的细胞符合预期设计要求，携带有稳定的目的基因，能够持续表达有功能活性的目的产物，没有微生物污染和混杂其它细胞，能够直接扩增储备或者应用于生产。
    对于原始库细胞和/或主库细胞，通常需要进行一次全面系统的研究检定，包括遗传学、生物学和微生物学，以便从源头开始严格控制起始细胞的一致性和防止污染。经过传代稳定性研究的主细胞到工作细胞，只经过简单的传代、扩增，可以适当简化检定项目，重点检测外源因子污染和防止混入了其它细胞。保存的数目和传代水平应保证生产用细胞的持续稳定供应。
（一）细胞鉴定
1、细胞种属的鉴定
   应验明细胞的种属来源，分析细胞的同一性，排除与其它细胞的交叉污染。
   目前常用的方法有细胞生长特征和培养形态学检查、种属特异性抗原检测、染色体核型分析、同工酶分析、限制性内切酶分析、基因多态性分析等。应结合具体细胞固有的特性进行适宜的组合和选择，以实现正确鉴别为目的。
2、致瘤性试验
    应检测分析目的基因引入细胞后的致瘤性特征，对于阳性细胞，应研究确定致瘤性特性、强度改变对产品带来的安全性风险。
3、目的基因和表达框架分析
    目的基因和表达框架的确证是种子库细胞检定的重要组成部分，对于表达正确的目的产物具有先决性意义。常用的方法包括：通过PCR扩增样本DNA或用从细胞基质中分离的RNA制备的cDNA来进行DNA序列分析；通过限制性内切酶谱和Southern杂交来检测基因的完整性，确定目的基因的拷贝数，并检测是否有任何序列插入或缺失等。
    基因序列分析资料应包括试验方案和步骤、原始的测序图、测得序列以及翻译后的氨基酸序列，同时应将实际测得序列与理论序列进行对比。清楚标注两者之间的异同。
    为保证产品结构的正确和持续一致，应在重组工程细胞的筛选和鉴定、细胞库的建立和检定、工艺研究过程中的培养终末期及超过终末期一定水平等不同阶段，采集代表性细胞完成必要的基因序列分析（包括目的基因侧翼区域）。
4、表达产物检测
    应检测分析目的产物的表达量和生物活性。活性测定应选择与其治疗机理相对应并能够定量的方法。活性测定方法学研究可贯穿于药品研究的始终，并经相关验证分析。
（二）微生物污染检测
1、细菌、真菌和支原体检查
    应对MCB、WCB和工艺研究过程中的EPC（生产终末期细胞）进行一次全面检查，对生产培养过程中的细胞进行定期监测。具体方法见参考文献[1]。在进行支原体检查时，应注意同时进行直接培养法和指示细胞染色法两种方法。必要时可采用扫描电镜法检查细胞是否受到特殊微生物的污染。
2、病毒因子的检查
    包括细胞来源宿主动物潜在的内源性病毒和由于操作带入的外源性病毒的检查。对细胞进行病毒检查的种类和方法，应根据细胞的种属和组织来源、传代历史和细胞特性选择。
2.1、体外试验
    应将MCB、WCB和EPC细胞活细胞或细胞裂解产物接种到尽可能多的病毒易感的指示细胞上。 可以根据细胞来源，传代史和细胞培养基的原料使用情况来选择适宜的指示细胞。检测结果应为阴性。具体方法见参考文献[1]。
2.2、体内试验
    可通过接种乳鼠、成年小鼠、鸡胚、豚鼠、家兔或其它敏感动物来检测细胞培养物中潜伏性病毒。一般应对MCB、EPC进行体内试验。具体方法见参考文献[1]
2.3、特异性病毒的检定
    通过抗体产生试验来检测可能存在于MCB细胞中的特异性病毒，如啮齿类动物来源的细胞应进行小鼠、仓鼠或大鼠的抗体生成试验。严格控制对于人类有危害的鼠源性病毒。
2.4、逆转录病毒的检测
    逆转录病毒的试验应包括感染性试验、逆转录酶(RT) 检测和电镜技术检查。应采用上述方法对MCB和EPC细胞进行逆转录病毒的检测。
2.4.1、感染性试验
    应根据细胞的特性及可能存在的逆转录病毒种类选择适宜的检测方法，如XC空斑试验（XC plaque）、延时XC空斑试验、S＋L－灶点分析（S＋L－Focus）等。试验时应注意设立恰当的阴/阳性对照。
2.4.2、逆转录酶检测
    对于常规条件下检测结果为阴性而又高度怀疑的细胞，为提高检测的敏感性，可考虑将受试细胞经适当的化学诱导剂诱导后，收集上清液分别与检测细胞联合培养，再检测逆转录酶的活性，注意设立恰当的阴/阳性对照。
2.4.3、透射电镜检查
    透射电镜下可观察细胞基质超微结构的形态学特征以及逆转录病毒和病毒样颗粒的存在，应比较未经和经过化学诱导剂诱导的细胞。另外，需要对细胞培养液超速离心后所得的沉淀物经负染后进行检查。观察有无逆转录病毒颗粒以及颗粒的类型。
    上述三种方法具有不同的检测特性和灵敏度。因此，应采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查或感染性试验，如果确证对人或者其它灵长类动物细胞有感染性的逆转录病毒颗粒，该细胞不得用于生产。
六、细胞稳定性研究
    应包括库细胞、生产过程中细胞、生产终末期和/或超过生产终末期一定阶段等不同培养时期的细胞。库细胞应重点考察贮存、复苏等操作处理因素的影响和传代过程中的遗传稳定性，在此基础上确定库细胞传代限度；生产过程中细胞、生产终末期和/或超过生产终末期一定阶段的细胞应考察模拟生产工艺和培养条件对细胞生长状况、表达能力等的影响，并确定生产细胞增殖限度和/或连续培养时间；使细胞始终能够持续、稳定地表达重组制品，并将对终产品产生安全性影响的风险因素严格控制在最低限度。
（一）贮存条件下的稳定性
    当储存的细胞复苏后用于生产制品时，应进行细胞存活率和功能活性等与细胞质量密切关联项目的研究测定，以证实复苏细胞表达能力的稳定性。应有对建库细胞贮存条件下稳定性监测的方案。这种监测应在一支或多支冷冻保藏的WCB复苏后制备生产用细胞时进行，或当一支或多支冷冻保藏的MCB 复苏并用于制备新WCB时进行。如果长时间未进行生产时，应按上市申请时所述的间隔时间对生产用细胞库进行活力测试。如果细胞的活力没有明显的减退，一般不需对MCB 或WCB 作进一步检定。
（二）传代/扩增过程中的稳定性
    应对库细胞和生产过程细胞进行传代/扩增的稳定性研究，可将复苏的库细胞连续传代培养至一定的代次和将工作库细胞在模拟实际生产条件下连续培养、扩增（逐级放大扩增过程），直至预期培养时间以及超过预期时间之外的延长时间点，收获后进行检测分析。通过考察目的基因、表达框架等在重组工程细胞中的传代稳定性和目的产物表达的稳定性，制定库细胞的限传代次和生产细胞的增殖限度以保证实际生产过程中细胞整体扩增水平以及伴随的内源性病毒和/或致瘤性风险等的抑制状态在预期限度范围内。至少应包括以下方面的试验研究：
1、基因水平的比较 
    目的基因编码序列和表达框架不应有错误，包括突变、缺失、插入。并注意比较基因拷贝数的变化。
2、目的产物表达水平的比较
    目的产物的表达量和表达活性不应有明显降低，根据不同的产品和具体研究结果确定适宜的可接受标准。
3、细胞自身的稳定性
    应重点检测细胞在传代/扩增过程中的形态、生长、代谢等基本状况，遗传特征和致肿瘤特性的变化。
4、内源因子检查
    应动态考察内源因子的复制是否得到有效抑制。重点检测由细胞来源动物和宿主细胞特性所决定的易染病毒如内源性逆转录病毒，分析其对于人类的致病性和重要性，严格控制其产生的条件。
5、致瘤性监测
    应通过比较研究考察细胞培养传代过程中致瘤性特征的改变，例如试验阳性时的细胞代次、最低接种量、肿瘤转移扩散、肿瘤增殖时间、瘤组织病理特征等。
七、生产过程细胞质量控制
    种子库细胞应在全面质量研究和检测分析基础上，模拟实际生产过程进行扩增培养，并检测分析目的基因表达的稳定性、细胞生长状况、污染控制、致肿瘤风险性等；规模化生产后须建立细胞生产培养过程的监控标准，产品生产细胞培养终末期应符合质量控制相关要求。
    对于内源性逆转录病毒和/或致瘤性试验阳性的细胞，应依据工艺处理能力制定风险性成分的控制条件，并根据模拟生产状态下取得的试验研究数据制定废弃收获液的标准；生产工艺必须包括有效的病毒和/或致瘤性成分的灭活/去除方法并经过充分验证。
    在研究建立了培养生产条件之后，如果整个培养过程中的关键环节例如培养基、培养条件、培养时间和/或限制代次、培养方式等发生重大改进，细胞培养工艺进一步放大，且影响了原已确定的监控标准，需要重新调整设立技术参数和条件时，应重复进行一次全面的检测验证。
（一）常规生产过程监控
    经研究确定了生产工艺条件之后，常规生产过程中可重点监测微生物污染和细胞生长状况，例如活细胞数目和形态、代谢和功能状态、目的蛋白表达状况、内源性逆转录病毒的复制、外源因子等，在比较分析的基础上确定批次或者连续培养生产的终末细胞的检测项目及可接受标准。
（二）细胞增殖限度
    在细胞稳定性试验研究的基础上，应结合细胞培养、维持等工艺过程中实际采用的生产方式如批式培养（batch culture）、流加培养(fed-batch culture) 、灌注培养(perfusion culture)等各自特点，考察细胞体外连续扩增、培养过程中发生的变化，例如细胞的生长状态、内源性病毒抑制状态、目的蛋白表达的下降程度以及致瘤性改变等确定适宜的收获方式、收获时间、细胞终止培养时间和/或增殖代次，并预留充分的安全储备。实际生产过程中细胞不得超过预先设定的培养时间和/或增殖限度。
（三）其它风险性因素控制
    培养基对细胞的质量有直接的影响，也是细胞污染的可能来源之一。应明确培养基的组成、来源及质量标准。对于动物源性添加成分，应尽可能控制并减少其使用；如确需使用，应阐明选择的理由，并说明该成分的来源和病毒安全性控制方法。目前提倡采用无血清培养基，并尽可能减少用于处理细胞（例如从贴壁状态中游离或者分散）的动物来源的蛋白酶。各种培养基的来源和质量检测数据均应有可追溯的文件记录。如培养中使用了牛源性物质，应明确其来自非BSE疫区，并应按照国家食品药品监督管理局的相关规定提供必要的证明性文件。
    细胞培养条件的研究中，对于内源性逆转录病毒和/或致瘤性试验阳性的细胞，在权衡风险性基础上开展必要的研究，关注病毒和/或癌基因相关序列的激活或者复制状况。
八、小结
    宿主细胞来源应明确，其建立、传代和保存过程清楚，鉴定结果可靠，遗传、生物学背景可追溯；
    工程细胞的克隆构建、筛选过程应规范，克隆原始细胞在比较优化的基础上经过确认检测；起始细胞稳定、均一和同质，建立了规范的细胞库（以下简称库细胞）并经过充分检定，保存的数目和传代水平应保证生产用细胞的持续稳定供应；
    对于原始库和/或主库细胞，应进行过至少一次全面系统的研究检定；工作库细胞经过简化项目的检定和外源因子污染检测，没有混入其它细胞；
    生产用WCB细胞每次复苏后应经过有代表性意义的常规质控项目的检测分析，以证实库细胞在复苏时仍保持冻存时原有的细胞特征。
    细胞应经过全面的稳定性研究考察，以确定库细胞的限传代次和生产细胞适宜的扩增控制水平，并在生产过程中严格执行限定的要求。重组工程细胞在整个培养生产过程中其遗传学和生物学特征应保持稳定；对于内源性逆转录病毒和/或致瘤性试验阳性的细胞，在权衡风险性基础上开展必要的研究，关注病毒和/或癌基因相关序列的激活或者复制状况。
    细胞培养基的来源和质量标准应明确，动物源性添加成分须符合国家有关规定；
    在细胞培养工艺研究阶段，对生产终末细胞和/或超过终末期一定阶段的细胞应进行过一次全面系统的检测分析研究，包括一般检定、遗传和生物学特征检测分析、目的基因和表达框架的稳定性分析、外源因子污染状况分析以及其它需要严格限制的风险性因素；生产工艺包含有效的病毒和/或致瘤性成分的灭活/去除方法并经过充分验证，纯化步骤能够使病毒和/或致瘤性成分得到有效去除，并严格执行研究确定的控制条件。
    常规生产过程中应设立适宜的监控指标，动态跟踪监测细胞的增殖、生长、污染等状况，并控制在警戒范围内，制定废弃收获液的标准。如果已研究建立的培养生产条件发生重大改变，如培养基、培养条件、培养时间和/或限制代次、培养方式等关键环节发生重大改进，细胞培养工艺进一步放大，以至影响了原已确定的监控标准，需要重新调整设立技术参数和条件时，应重复进行一次全面的检测验证。
    总之，细胞质量研究、检测和监控应包括从起始的库细胞至生产终末的整个扩增和维持培养全过程，生产中应严格执行研究确定的控制条件，使细胞始终能够正常表达、分泌具有生物活性的目的产物，微生物污染、致瘤性等风险性因素得到有效控制。
九、名词解释
   宿主细胞：系指用以载纳和表达外源目的基因的细胞系或者细胞株。
   重组工程细胞：系指携带有外源目的基因并能够持续稳定表达重组目的产物的工程化细胞。
   细胞增殖限度：在既定培养条件下，库细胞从复苏开始至生产终末期为止的整个培养过程中，为有效控制细胞生长状态或者变异的程度，使其始终处于持续、稳定的表达状态所界定的相关要求，包括库细胞限传代次和生产细胞培养限度。通常采用固定条件下细胞培养和维持时间、细胞群体倍增水平或者限传代次等指标加以限制。
   细胞库、原始细胞库、主细胞库、工作细胞库的概念和定义见参考文献[1]。
   
十、参考文献
1、中华人民共和国药典2005年版三部.生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程，2005
2、FDA. Points to consider in characterization of cell lines used to produce biological products, 1989
3、FDA. Points to consider for the characterization of cell lines used to produce biologicals and for the manufacturing and testing of monoclonal antibody for human use，1997
4、ICH. Guideline for viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human and animal origin, 1996
5、EMEA. Position statement on the use of tumourigenic cells of human origin for the production of biological and biotechnological medicinal products, 2001