审评四部 刘 宁
注射剂作为药品的一种重要剂型被广泛地应用于临床，由于其直接注入人体体内，发挥疗效，因此其安全性显得更为重要。现在对于注射剂的质量越来越受到高度关注，其中注射剂的灭菌是关系到药品质量、保证用药安全的重要工艺步骤之一，选择合适的灭菌方法，做到既杀灭除去微生物，达到灭菌目的，又保持药物稳定。无菌检查是体现灭菌效果的主要手段，也是注射剂质量控制的一个重要指标。在这里，结合审评实践，对注射剂在研发和药学审评中存在的一些无菌检查及方法学验证方面的共性问题进行探讨。
无菌检查是检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。2005年版中国药典无菌检查要求更加严格，修订了培养时间，把无菌检查的培养时间增加至14天（而2000年版的培养时间仅为7天），与国外药典完全一致，并新增了无菌检查方法学验证试验，以保证无菌检验结果的准确性和可靠性。
无菌检查法一般分为两种方法：直接接种法和薄膜过滤法。直接接种法即每支（或瓶）供试品按规定量分别接入含培养细菌及真菌培养基的容器中。薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径为0.45µm，直径约为50mm。根据供试品及溶剂的特性选择滤膜的材质。如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜。滤器及滤膜采用适宜的方法灭菌；使用时，要保证滤膜的完整性；水溶性供试品，先用少量冲洗液湿润滤膜。油类供试品，滤膜和滤器，在使用前应充分干燥，备用。过滤时，保持供试液及冲洗液覆盖整个滤膜表面； 冲洗滤膜时，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法与方法验证相同。2005年版中国药典都较详细地各提供了8种供试品的处理方式，在实际检验中可参考执行。
下面要谈谈无菌方法学验证研究问题。在注射剂的申报资料中，无论是仿制药还是创新药，申请人一般对无菌检查给予的关注似乎不够，提供了这方面资料的也较少。但实际上，无菌检查带来的影响还是比较大的，当建立药品的无菌检查法时，应进行方法验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查；当供试品为新的产品或供试品的检验条件发生改变时，应重新进行方法验证试验，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。
方法验证：1.薄膜过滤法是将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。取一支装有同体积培养基的容器，加入等量的试验菌，作为阳性对照，按规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。2.直接接种法是指取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8支，分别接入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液1ml(含菌小于100 cfu)各两管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1ml(含菌小于100 cfu)各两管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养3～5天。与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，增加培养基的用量，使用中和剂如ß-内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨脂80等，更换滤膜品种等方法消除供试品的抑菌作用，并重新进行验证试验。
2005年版中国药典对方法验证试验进行了系统化的规定和要求，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。某些供试品含有抗微生物物质，使供试品中的活微生物的生长被抑制，不能按常规方法检验，必须以适当的方法消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性后，活微生物才能生长得以检出。通过消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性来检验微生物的方法，应通过验证，以确定所用检验方法测定结果的可信度。方法验证试验就是利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响，通过模拟实验对降低或消除效果加以检验。
审评中我们注意到，申报资料中进行的无菌检查存在一些问题，如无菌检查方法中仅简单的提及采用薄膜过滤法应符合规定，并未详细提供方法验证资料；有的申报单位在质量标准中制定了无菌检查项，但仅为“依法检查，应符合规定”，在质量研究资料中也没有对方法进行验证，因而无法对方法进行评价；有的注射液如葡萄糖、氯化钠等不含抑菌作用大输液的无菌方法，直接冲洗量达1000ml，可看出根本未进行方法研究；还有无菌方法验证不完全，比较简单粗糙，无法判断是否为合理的方法等等。
下面针对审评工作中接触的一些问题，谈谈看法和思考：
1. 培养基与菌种方面：做无菌实验前进行培养基的适用性检查是很有必要的，培养基的适用性检查包括培养基的无菌性检查和培养基的灵敏度检查，以确保初步环节可靠。验证用菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、枯草杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉，中检所老师要求应加上大肠埃希菌，一共七株菌，对每一试验菌应逐一进行验证；由于使用频繁，对菌种的要求为不得超过5代，采用适宜的方法保存；加菌量应小于100cfu，一般50～100cfu比较合适，过多过少均影响判断结果。有的申报资料中未提供试验菌的浓度，这一点往往被忽视。
2. 样品取样量方面：申报资料对此比较混乱，中国药典2005年版附录三个表格有明确的解释和规定。检验数量是指一次检验所用供试品最小包装容器的数量；检验量是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。检验量的表格不包括阳性对照用的用量，虽然有专门说明，但仍容易忽略。无菌检查应保证检验数量以使试验结果具有代表性；而阳性对照和验证试验满足检验量总量要求即可以检验样品对试验结果的影响，即保证实验结果的可靠性。
3. 操作方法方面：直接接种法取样量少，方法繁琐，且易受外源性细菌污染,对操作者和操作环境要求高，对实验结果的影响较大。薄膜过滤法采用大取样量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，仪器操作简单。该系统是全封闭过滤系统,避免了操作过程中外源性细菌的污染，对实验结果的可信性影响较小。取样量大于5ml/支直接接种法不再适用，发展趋势采用全封闭的薄膜过滤法。
4. 样品处理方面：注射剂有不同剂型，对于注射液还比较好过滤，但对于其他剂型要注意处理方式。如粉针剂，要关注固体样品的溶解、转移、均匀分配问题，通常将规定取样量全部转移到400～500ml稀释剂或适宜溶液中，再进行分配。还有一些特殊剂型，像非水溶性的供试品，比如在审评中接触到的乳剂注射液，有的申报资料直接用0.1％蛋白胨水冲洗，这样溶解冲洗不完全，影响结果；应注意使用加入适量的聚山梨酯80或其它适宜乳化剂及稀释剂，稀释后立即过滤，再进行研究。在对可溶于十四烷酸异丙酯的油类供试品进行处理时，无菌的十四烷酸异丙酯用量需经方法学验证。
5. 冲洗方法：冲洗是为了消除供试品中的抗菌活性，应执行少量多次的冲洗原则，每次50ml，要充分振摇。在方法验证资料中应注明冲洗量和冲洗量确定的过程及理由，一些申报资料过于简单，把冲洗量列出就算完事，冲洗量得出的筛选过程不得而知；一般冲洗体积每张膜不应大于1000ml，每张滤膜每次冲洗量最大不得过100ml。根据实验经验，如冲洗液已经达到冲洗极限，还不能有效去除抑菌活性，再通过增加冲洗体积一般也无济于事，这时应考虑改变其他冲洗条件。比如加入中和剂，如β-内酰胺类抗生素供试品，用冲洗液冲洗数次后，可考虑最后一次用适量的β-内酰胺酶冲洗液清除残留在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基；或将滤膜直接接入含适量β-内酰胺酶的培养基。中和法应特别注意所用试剂对微生物的损伤，须通过试验证明其可行性，若无报导，试验菌株的范围要广。加入其他表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响，而且所加中和剂的量也需要验证。另外有的品种虽本身没有抑菌作用，但需考虑可能加有防腐剂的冲洗方法。
6. 验证实验还应同时进行阳性对照实验和阴性对照实验，应根据供试品的特性选择相应的阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。而阴性对照实验则是每次无菌检查所用的溶剂、稀释剂和冲洗剂同法操作，作为阴性对照。 阴性对照不得有菌生长。
7. 其他方面：参照中国药典2005年版原料药与药物制剂稳定性试验指导原则要求，作为注射剂特点，无菌检查应作为稳定性重点考察项目，对有效期的制定和合理的储存条件提供重要的考察依据。但在实际申报过程中有的品种未进行无菌稳定性考察，这方面理应引起重视。
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