生物样本分析样品稳定性考察的技术要求分析

审评四部审评八室郑国钢

化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究及化学药物临床药代动力学研究两个技术指导原则中对生物样本分析样品稳定性(Stability)规定如下:根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻或冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性，以保证检测结果的准确性和重现性。
从指导原则中我们可以理解样品稳定性包含了5个方面，但申报资料中往往只对其中的2～3项进行考察，应引起审评注意。
（1）冰冻稳定性（冷冻稳定性）：配制好数份低、中、高含药生物样品后冰冻，分别在数天或数十天时，取出化冻测定血药浓度，计算回收率来考察稳定性。冷冻稳定性（常规为－20℃）的目的是考察样品贮存的低温极限条件。因此所有样品分析必须满足一定时间内在特定的贮存温度下的稳定性要求。如有些样品冻存仅一周稳定，不能满足样品分析周期要求，可采用合适的方式延长冷冻稳定性，如采用超低温冰箱保存降低冰冻温度，也可采用加入适当的稳定剂，如含巯基化合物，添加抗氧化剂维生素C能大大延长冷冻稳定性。
（2）样品处理后的溶液中分析物的稳定性（测定溶液的稳定性）：含药生物样品于配制好后按“血浆样品的处理”项立即处理，置室温中分别在数小时或数十小时时测定，常将测定溶液放置在低温进样器中考察。该实验的目的是，考察在样品量大、分析批内待机时间长所致的待测样品发生的变化或仪器污染/疲劳/基线漂移等所造成的系统偏差。
HPLC法中如采用UV或FLD检测，可采用统计样品主峰面积RSD%考察。生物样本污染较大，当采用MS或MS/MS检测时，连续进样易污染加热毛细管，导致主峰面积逐渐下降，此时需要同时跟踪线性测定进行考察。也可考察降解杂质的变化来判断，如含奥美拉唑生物样品通过考察主要降解杂质磺酰化物，这种方法有时更为准确。
（3）冻融稳定性：配制好低、中、高含药生物样品，冻融数次（常3次）, 测定血药浓度，计算回收率来考察稳定性。由于生物样品分析复杂、误差大，易产生可疑数据，往往需要重新测定来确定数据的可信度，该稳定性为上述测定提供保证。如含赖诺普利血样，冷冻放置7天内基本稳定，冻融两次赖诺普利降解50％以上。解决冻融不稳定性的办法有：血样采集分离后，立即定量分成多份冷冻方式，满足实验要求。
（4）室温稳定性：配制好低、中、高含药生物样品后，在室温条件下放置数小时至数十小时后，按“血浆样品的处理”项立即处理测定，计算回收率来考察稳定性。该实验目的考察血浆样品处理过程中，待处理样品放置的合适条件。如文献报道，含尼莫地平血样在室温稳定性较差，需要冻融后立即处理测定，但这种情况会影响测定的效率，经室温稳定性考察后发现，在严格避光条件下，血样在24h内稳定。
（5）储备液的稳定性：对照品储备液分别置冰箱中（4℃）放置数天数十天后，取出后直接测定，测定方法可不同于含药生物样品的测定。如仅放置几天，可采用测定条件连续测定，计算样品主峰面积的RSD%来考察；如对照品容易获得，可采用新配制对照品溶液外标法计算储备液的含量来考察；对于昂贵的对照品（如代谢物）可采用HPLC归一化法联合吸收系数法来考察待测成分的变化。
还需要强调的是，由于样品千差万别，理化性质各有不同，为保证测定的准确性，还需要视化合物不同开展其他的稳定性考察，如光解效应、氧化效应、吸附效应。

生物样本分析样品稳定性考察的技术要求分析

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